2019年10月1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿（niào）病研究（jiū）领域取得重要进展。2型糖尿（niào）病（T2D）的（de）血管并发症是导致2型糖尿病致残（cán）致死的（de）重要病因（yīn），一直缺乏一种无创便捷（jié）的临床途径（jìng）实现血管并（bìng）发症的（de）发生发展监测，达到早发现、早干（gàn）预（yù），以提高T2D病人的整（zhěng）体生（shēng）活（huó）质量，减少卫生经济负担。

该研究（jiū）入（rù）组了62例2型糖（táng）尿病病人，采用5hmC-Seal技（jì）术对血（xuè）浆cfDNA中表（biǎo）观遗（yí）传标志（zhì）物5hmC的分布情况进行检测，分析5hmC标志（zhì）物与2型（xíng）糖（táng）尿病（bìng）血管并发（fā）症发生发展（zhǎn）的相（xiàng）关性（xìng）。结果表明5hmC标志物的变（biàn）化与T2D合并大血管（guǎn）/微血管事件具有相关性，主要（yào）涉及一些与（yǔ）血管生物学和糖尿病（包括胰岛素耐受和炎症（zhèng）反应）相关的基因和信号通（tōng）路（lù）。该研究（jiū）建立的16个基因-5hmC标志物组合检测可以准确区分（fèn）有并发症（zhèng）和（hé）无并（bìng）发症的2型糖尿病病人（rén）[实（shí）验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临（lín）床变量（liàng）例如（rú）白蛋白（bái）尿（niào）。除此之外，还建立了13个基因（yīn）-5hmC标志物组（zǔ）合检测，可以进一步区分T2D合并单一并发症和多种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明（míng）显优（yōu）于其他（tā）传（chuán）统临床变（biàn）量。该（gāi）研究得（dé）出结论，5hmC标志（zhì）物反映（yìng）了T2D病人大血（xuè）管/微血管并发（fā）症发生过程中的表观遗传变化，因而（ér）5hmC-Seal检测技术（shù）在监（jiān）测糖尿病（bìng）血管并发（fā）症发生和进展方面（miàn）具有良好的临（lín）床应用（yòng）前（qián）景。

本研究（jiū）共（gòng）纳入62例2型糖尿病病人，包括没有血（xuè）管并发症的（de）病人12例，有单一血管并发症的（de）病人34例（24例发生大血（xuè）管（guǎn）事件，10例发生（shēng）微血管事件），以及有多种血管（guǎn）并发症（zhèng）的病人（rén）16例（lì）。试验（yàn）收集62例病人血（xuè）浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术（shù）捕（bǔ）获外（wài）周血（xuè）cfDNA中的（de）5hmC序（xù）列，进行二代测（cè）序，通（tōng）过生物信（xìn）息（xī）学（xué）分析（xī）找（zhǎo）出（chū）并发症组与无并发症组之间有显（xiǎn）著5hmC修饰（shì）差（chà）异的基（jī）因，单一（yī）并发症组和多（duō）种并（bìng）发症组之间有（yǒu）显著（zhe）5hmC修饰（shì）差异的基因（yīn）。随后利用（yòng）回归模型对差异基因（yīn）进（jìn）一步（bù）筛选、优化，弹性网络进（jìn）一步筛选，计算加权平（píng）均分，最后得到一组具有高度灵（líng）敏（mǐn）度和特异（yì）性（xìng）的5hmC生物标（biāo）记物，并进一步在实验组中验证（zhèng），分析其（qí）灵敏度和特异性。并将（jiāng）新建立的5hmC标志物基因组合的（de）检（jiǎn）测性能（néng）与传统临床变量进行对（duì）比分（fèn）析（xī）。最（zuì）后对相（xiàng）关基因进行了（le）信号通路分（fèn）析（xī）和功能（néng）探究。

5hmC修饰水平与血管并（bìng）发（fā）症具有相（xiàng）关性（xìng）

利（lì）用逻辑回归模型对（duì）62例有并发症和无并发症2型（xíng）糖（táng）尿（niào）病病人的5hmC差异水平（píng）进行分析（xī）发现，有并发症2型糖（táng）尿病病人的（de）622个差异修饰候选基因（包括上调和下（xià）调基因）的（de）归一化平均数（shù）要明显高于无（wú）并发症的病人（P<0.001），但是单一（yī）并发症和多发并发症病人之（zhī）间没有显（xiǎn）著差异（yì）。

之（zhī）后将有单一并（bìng）发症（zhèng）或多种并发（fā）症的50例病人用（yòng）逻辑回归模型进行了对比，发现多种（zhǒng）并发症的（de）病人的153个差异（yì）修饰候选基（jī）因（包（bāo）括上调和下调（diào）基因）的（de）归一化平均数要低于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有（yǒu）无并（bìng）发症患者

62例2型糖尿病病人（rén）被随机分成训（xùn）练组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性（xìng）网络筛（shāi）选后发现，16基因-5hmC标志物（wù）组合检测可以用于区分有（yǒu）并发症（zhèng）和（hé）无并发症的2型糖尿病病人。

基于（yú）16基（jī）因（yīn）组（zǔ）合模型 (Detection Model 1) 的（de）加权平均分分析，发现无并发（fā）症病人的分（fèn）数（shù）在训练（liàn）集和测试集中（zhōng）都明显低于有并发症的（de）病（bìng）人（rén）。只考（kǎo）虑加权平均（jun1）分（fèn）的话，受试者工（gōng）作特征曲线（ROC）分析（xī）表明将（jiāng）cutoff值设置成0.5时，在测试组（zǔ）中中的灵敏（mǐn）度为（wéi）60%，特（tè）异（yì）性为（wéi）100%。

5hmC标志物（wù）可区分病（bìng）人是单一并发症还是多种（zhǒng）并发症

50例有并发症的（de）2型糖尿病病人被（bèi）随机分成（chéng）训练组（n=25）和测试组（zǔ）（n=25）。利用弹性（xìng）网络筛（shāi）选后发（fā）现，13基因-5hmC标志物组（zǔ）合可以区分2型糖尿病病人是否发（fā）生单一并发症或（huò）多种（zhǒng）并发症（zhèng）。

基于13基因（yīn）组合模（mó）型 (Detection Model 2)， 我们计算了（le）单一并发症和多（duō）种并发症的（de）加权（quán）平均分，发现在训练集和测试（shì）集中单一并发症和多种并发症（zhèng）病人的分数都有明显差异。值得一提的是，有肾（shèn）病并发症和（hé）无肾（shèn）病并发症病（bìng）人的分数也有明显差异。利用加权平均（jun1）分作为判断标准的受试（shì）者工作特征曲线（ROC）表明，在测试组中当将（jiāng）cutoff值设成0.69时，灵（líng）敏（mǐn）度（dù）为87.5%，特（tè）异性为68.8%。

5hmC标志物（wù）与传（chuán）统临床变量/危险因子的对比（bǐ）

我（wǒ）们评估了不同（tóng）临床变量/危（wēi）险因子用于监测（cè）血管并发症的灵敏度和特异性（见表（biǎo）1）。

信号通路分析和功能探究

有并发症和无（wú）并发症病人（rén）的135个差异候选基因（yīn）的功能注释（shì）分析（xī）表（biǎo）明（míng），这些基因主要富集在一（yī）些（xiē）经典的信号通路（lù）。错误发现率相关P值位（wèi）于前10%和基因数目≥3的信号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通路。由IGF1R和IL-10介导的信号通路与胰（yí）岛素抵抗及炎症反（fǎn）应相关，在血管生物学（xué）和糖尿病发生发展过程中发挥重要（yào）作用。

Reactome相互作（zuò）用网络的中心表（biǎo）明，泛素编码基（jī）因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基核糖体（tǐ）蛋白融合产物（wù）1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个差异候选（xuǎn）基（jī）因（yīn）中, 一些（xiē）基（jī）因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出（chū）与糖尿病病程（chéng）相关的倾向（xiàng），表明5hmC和（hé）糖（táng）尿病血管并发症之间可（kě）能（néng）存在（zài）时间依赖性的相互作用。基于纵向（xiàng）时间队（duì）列的大样（yàng）本研究，将可进一步明确5hmC变化和糖尿病持（chí）续时间之间的动（dòng）态关联。关于单一并发症和多种并（bìng）发（fā）症病人的159个（gè）候选标志（zhì）基因的功能注（zhù）释研究发现（xiàn），存在细胞（bāo）-细胞连接、胶原蛋白形成、新陈代谢、细胞应激应答信号通路的富（fù）集，这些信（xìn）号通（tōng）路均与细胞基本功能密切（qiē）相关。

血管（guǎn）并发症是三（sān）分（fèn）之二糖尿病病人的死亡原因，若能及早有效控制血管并发症（zhèng）的发生，将极大地改善糖尿病病人的生存质量。该研究（jiū）建（jiàn）立了一（yī）种（zhǒng）利用cfDNA进行2型（xíng）糖（táng）尿病血管并（bìng）发症（zhèng）监测的无创便捷方（fāng）法，较目前临床标志物能更准确地监控血管（guǎn）并（bìng）发症的发生，从（cóng）而提示（shì）临床及早采取应（yīng）对（duì）措（cuò）施，有效控制病情进展。